本发明公开了一种甘蔗茎组织原生质体的制备方法和应用，属于植物原生质体技术领域。本发明通过采用多次低速离心与重悬的方法有效去除糖分物质，并采用改进包括取样部位、酶解溶液配方与解离时间等技术工艺参数的措施获得高纯度原生质体，达到每克组织4×10⁷原生质体。同时，通过技术参数优化发明了适用于上述甘蔗原生质体应用。本发明具有较高重现性，可稳定获得高质量甘蔗茎组织原生质体，实现转化效率达到75%以上的效果。本发明为甘蔗茎特异基因与蛋白质亚细胞定位、启动子功能验证等分子生物学研究提供了有效的研究技术；且操作简便易行，可推广应用于其它高糖分含量物种的原生质体制备和瞬时转化，具有广泛应用价值。