本发明公开一种运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法及其应用，该方法将所有靶标分子分为锚定分子和N组稀疏分子，每轮通过连接测序的方式读取全部锚定分子和其中一组稀疏分子，直至N组稀疏分子读取完毕。通过N轮成像，有效地将无法解读的高密度靶标分子信号稀疏成N组低密度信号，再通过锚定分子配准将解读后的N组稀疏分子进行整合，确定高通量高密度的空间分布模式信息。该方法通过增加成像轮数，拆分、稀疏高密度图像，换取空间位置，解决荧光信号点光学拥挤和干扰问题，获取高密度信号点的空间位置，无需通过超分辨显微成像系统在单细胞水平实现高通量、高密度荧光信号的精准空间分辨的解析，打破目前的技术限制。