本发明提供了一种吗啉‑茚酮‑查尔酮衍生物荧光探针及其制备方法和应用，其中吗啉‑茚酮‑查尔酮衍生物的化学结构式如下：；制备方法为：将5‑羟基‑1‑茚酮、4‑(4‑吗啉)苯甲醛和氢氧化钠溶解于有机溶剂中回流搅拌反应，盐酸酸化至pH＝6，处理后得中间体5‑羟基‑2‑（4‑吗啉苄基亚基）‑2，3‑二氢‑1H‑茚酮；将其与乙酸酐、三乙胺溶解于有机溶剂中；在室温下搅拌反应得吗啉‑茚酮‑查尔酮衍生物荧光探针。本发明的吗啉‑茚酮‑查尔酮衍生物荧光探针在95%水相（含5%二甲基亚砜，v/v）条件下能够选择性的与羧酸酯酶（CEs）作用，绿色荧光显著增强，特别是作为CEs荧光探针在细胞溶酶体荧光成像中的应用。