本发明公开了一种多层微流控玻璃芯片封装的制作工艺，包括以下具体步骤：S1：设计微通道图像：根据芯片的工作原理以及相应的应用要求设计芯片微通道的路径结构，并利用菲林做出微通道路径结构的掩膜；S2：通道成型：顺序通过光刻和蚀刻的方式将设计微通道图像步骤中的微通道路径结构刻在玻璃底基上；S3：钻孔：以设计玻璃底基上的微通道路径结构中的定点为依据，对其进行钻孔；S4：玻璃片表面预处理：对每片玻璃片的表面进行加工处理，保证后续步骤的顺利开展；S5：装夹组合；S6：后处理；S7：查验封装。本发明公开的多层微流控玻璃芯片封装的制作工艺具有突破了多层键合技术的空白的效果。