本发明公开了一种骨痂巨噬细胞分离用组合试剂及其应用，所述组合试剂主要包括A液和B液，其中：A液主要由2wt.%Ⅱ型胶原酶溶液、2.5wt.%胰蛋白酶‑EDTA溶液和RPMI 1640培养基组成，所述2wt.%Ⅱ型胶原酶溶液、2.5wt.%胰蛋白酶‑EDTA溶液体积比为1~3：1~3，所用溶剂均为无钙镁PBS缓冲液，所述2wt.%Ⅱ型胶原酶溶液、2.5wt.%胰蛋白酶‑EDTA溶液的溶液总量与RPMI 1640培养基体积比为1：3；B液：无钙镁PBS缓冲液中加入2 wt.%的血清。本发明的组合试剂可高效、彻底的消化骨痂组织，制备高活性的细胞悬液，并能很好的保留巨噬细胞中的表面标记物，避免关键表面标志物F4/80的丢失；所使用材料易得并且毒副作用小，分离骨痂中巨噬细胞的消化操作方法简易行，减少实验负担。