本发明提供了一种莱古比星的分离纯化方法。该分离纯化方法包括如下步骤：1)将莱古比星粗品溶解过滤，得到莱古比星溶液；2)将步骤1)得到的莱古比星溶液上样到装有硅胶微球的层析柱中进行层析，采用有机溶剂为流动相进行洗脱；3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，得到纯化的莱古比星。本发明莱古比星的分离纯化方法，仅需一步层析纯化即可满足莱古比星纯度＞99％的要求，收率可达70％以上，纯化收率高而稳定，同时本发明的分离纯化方法简单方便，可用于规模化生产，大大降低了生产成本。