本发明涉及核酸检测试剂技术领域，且公开了一种基于荧光检测的多酶恒温核酸快速扩增试剂及应用，包括核酸外切酶、缓冲液、氯化钾、氯化镁、恒温聚合酶、荧光染料、乙酸镁、探针、甘油、甜菜碱、甲酰胺、一对引物和逆转录酶，所述核酸外切酶的含量为16ng/μL‑20ng/μL，缓冲液的体积含量为6％到8％，氯化钾0‑200mM，氯化镁5mM‑100mM，恒温聚合酶的含量为16ng/μL‑20ng/μL，乙酸镁的含量为11mM‑15mM。该基于多酶恒温核酸快速扩增试剂及应用，该试剂可以在常温下进行使用，且该试剂在使用时反应温度保持不变，不需要工作人员反复改变试剂的反应温度，简化了该试剂使用步骤，能够提高工作人员的工作效率，且该试剂降低了对扩增模板核酸纯度的要求，提高了该试剂的实用性。