本发明公开一种评估抗生素耐药基因迁移风险的方法。该方法包括：提供第一目标菌株和第二目标菌株，其中第一目标菌株具有双荧光信号，第二目标菌株具有多抗生素敏感性；使第一目标菌株在待测样本中与第二目标菌株在适于接合的条件下接触得到接合子；对接合子进行荧光检测。本发明的方法可快速评估抗生素耐药基因迁移的风险，有效解决现有计算迁移频率的方法中存在的费时费力的缺陷，同时快速评估不同环境条件对耐药基因水平迁移的风险。此外，本发明构建的双荧光耐药性大肠杆菌作为研究抗生素耐药基因的水平接合转移的供体菌，还可以对耐药基因进入植物或水生生物肠道进行快速定位，从而实现耐药基因迁移可视化。