本发明涉及一种固定化脂肪酶法在非水相体系催化醇解动植物油脂生产生物柴油的方法，该生产方法包括海藻酸钠、高岭土、戊二醛、明胶、乳糖组成的共固定剂对脂肪酶的固定化，球形固定化酶以自然状态堆积在填充床酶柱反应器中，在生物柴油作为溶剂的条件下醇解动植物油脂，生产生物柴油。本发明所述的生产方法反应条件温和，能耗低，并且可以连续化生产，大大降低了生产成本，同时本发明使用生物催化剂，反应特异性强，副产物少，所制得的生物柴油具有色泽浅、品质高的特点。