本发明涉及一种以西尼罗病毒E基因片段为靶目标设计合成的生物制剂，尤其是能够直接对西尼罗病毒进行快速检测的试剂以及这种试剂的制备方法和在试剂盒中的应用。本发明系选择西尼罗病毒特异而各型病毒间比较保守的E基因片段为靶目标，经过精心设计、合成一大批引物和探针。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，并经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，得到最适合的引物和探针。本发明所述的西尼罗病毒荧光定量RT－PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为71bp。本试剂可直接对西尼罗病毒核酸进行快速检测。