本申请公开了一种基于二代测序的肿瘤新生抗原检测方法、装置和存储介质。本申请的肿瘤新生抗原检测方法包括，变异检测步骤、MHC分子鉴定步骤、变异注释步骤、突变肽段预测步骤、突变肽段MHC/II型亲和力预测步骤、抗原表达丰度检测步骤、克隆性分析步骤和候选肿瘤新生抗原综合打分排序步骤；其中，新生抗原综合打分排序步骤包括按照公式一，根据MHC亲和力、抗原表达丰度和克隆性对新生抗原进行打分排序。本申请的肿瘤新生抗原检测方法，直接以二代测序的比对文件为基础进行突变和MHC检测，并且从MHC I/II型亲和力、抗原表达丰度、克隆性三个维度对候选肿瘤新生抗原进行打分，从而筛选出高质量的肿瘤新生抗原，为基于肿瘤新生抗原的免疫治疗奠定了基础。