一种检测葡萄糖基转移酶的比率型荧光探针及其应用，其属于生物医药技术领域。该探针具有4‑羟基萘酰亚胺结构母核，为比率型荧光探针，其经葡萄糖基转移酶催化后的糖基化产物仍然具有荧光属性，根据探针底物及其葡萄糖基化产物的荧光强度比率，用于测定体系内葡萄糖基转移酶的活力。所发明探针可以用于重组表达的葡萄糖基转酶的活力分析，亦可用于检测不同种属、不同个体来源的生物样本中的葡萄糖基转移酶的活性测定。特别是，以糖苷类成分为主要药效物质的植物类药材，应用本探针测定分析其中的葡萄糖基转移酶的表达情况对于药材的种植采收以及质量控制具有重要的指导作用。