本发明公开了一种长余辉分子信标探针、其构建方法及应用。所述长余辉分子信标探针包括：分子信标；分别修饰于分子信标的两个末端的荧光供体材料及能量受体材料；其中，所述荧光供体材料包括稀土基长余辉发光材料、磷光/长余辉发光碳量子点、磷光半导体量子点等，所述能量受体材料为淬灭剂，所述淬灭剂包括具有淬灭长余辉性能的光学材料。本发明采用的长余辉发光材料的制备步骤更简单、水溶性好、发光更稳定、发射寿命更长，所构建的基于长余辉发光的时间分辨分子信标探针信噪比和灵敏度更高，将其应用于体外生物样本中微小RNA的高灵敏检测，为分子信标探针的设计提供新策略。