本发明提供基于总变分区域选取的明视野显微镜全景图像对齐算法，包括如下步骤：输入若干待拼接图像，提取先验重叠区域，二次总变分提取特征区域，采用MSE均方误差计算相对偏移，计算图像全局偏移，拼接全景图像结果；采用基于二次总变分的方式进行区域选取，找出内容丰富且图像边缘信息强的区域作为对齐模板，然后利用像素信息通过MSE度量匹配最佳位置，结合双边总变分加权的方式来确定相邻图像间的偏移，达到兼顾两方向对齐的目的，对相邻两张视野图的重叠量获取一个先验知识，从而克服了基于像素的对齐方式计算复杂度高的缺点。