本发明提供了一种从发酵液提取FR901464的方法，发酵液由伯克霍尔德菌发酵得到。发酵方法包括：将大孔树脂加入发酵液，混合吸附后过滤；将过滤得到的大孔树脂用有机溶剂浸泡分离，并将分离后的有机溶剂浓缩；浓缩后产物用正己烷与乙酸乙酯混合溶剂溶解，用硅胶进行色谱分离后，用乙酸乙酯洗脱得到洗脱液；浓缩洗脱液至膏状，随后配制成上柱液，上柱液用高压液相色谱仪进行分离纯化，填料为C18填料，用液相洗脱剂洗脱得到洗脱液；洗脱液经萃取后收集有机相，蒸干后形成固体粉末。