本发明公开了提供一种检测多个单核苷酸多态性的方法、试剂盒及其应用，属于基因检测技术领域，该方法主要包括：根据靶标基因序列，设计上游引物、下游引物和两条邻近单标记探针，配制多重PCR反应体系，采用引物对称扩增方式进行扩增，然后进行熔解曲线分析。本发明利用两条邻近单标记探针与靶标结合/解离状态下的荧光信号差异，增强区分SNP等位基因的能力，使多重PCR的判读更加清晰。本发明通过引物对称扩增+快速降温的方式获得单链扩增产物，能有效降低多重引物体系间的扩增效率差异，解决高GC模板扩增问题。本发明方法突破多个单核苷酸多态性检测的技术瓶颈，为临床提供一种结果稳定、判读简单、通量高、周期短、成本低的多重SNP检测方法。