本发明提供了一种基于分子探针的异噻唑啉酮检测方法。该技术方案摒弃了常规的发光检测路线，采用亚硫酸氢钠与异噻唑啉酮反应，从N‑S键处实现开环，所得产物可作为分子探针，从而进行定量检测。具体来看，本发明首先利用甲醇溶解待测样品，而后与特定量的碳酸钠溶液混合，并通过搅拌充分沉淀杂质；在此基础上，与亚硫酸氢钠混合并在加压低温条件下充分反应，反应产物与聚乙二醇混合后过WCX固相萃取柱，得到初步纯化，对所得的洗脱液，采用C8柱进行HPLC检测。本发明检测方法操作简便，检测速度快，响应灵敏，检出浓度低，具有良好的推广前景和突出的技术优势。