本发明公开了一种原子力显微镜中胶体探针的制备方法，将有机物粉末和光敏胶分别均匀填充在微孔板两侧的孔隙中，涂平压实，在原子力显微镜光学成像系统下利用控制系统将探针悬臂自由端先浸入光敏胶中，然后退针，此时在悬臂自由端形成胶体微球，再将悬臂自由端浸入有机物粉末中，静置使有机物粉末包裹胶体微球，退针，待光敏胶固化后即获得有机物修饰的胶体探针。本发明分别将有机物和光敏胶均匀填充在微孔板两侧孔隙中，可以达到定量控制光敏胶和有机物的量，避免悬臂上过多的修饰物而改变悬臂自身的弹性系数和激光反射率，提高了原子力显微镜纳米力学测量的灵敏度和准确性，该方法无需其他辅助操作系统，操作简单，成功率高，可以批量制备。