一种金属纳米线生物传感器及其制备方法和应用。所述金属纳米线生物传感器包括：基底；设置在基底一侧表面的绝缘层，绝缘层上设置有凹槽；设置在凹槽中的金属纳米线，并且金属纳米线的厚度大于或等于凹槽的深度；设置在绝缘层一侧的信号采集电极，信号采集电极包括电极垫、电极连接线和纳米线连接部，纳米线连接部与金属纳米线连接，电极垫与外部电路连接；绝缘保护层，绝缘保护层设置在绝缘层、金属纳米线和信号采集电极远离基底一侧的表面并且暴露出金属纳米线的传感区和信号采集电极的电极垫。本申请提的金属纳米线生物传感器不会受到流体冲刷与微流控管道键合过程的剪切力影响，金属纳米线线体更牢固，传感器的稳定性和灵敏度更高。