本发明公开了一种基于混池文库创制基因编辑植株的高通量分子鉴定方法及应用，方法为：对T0代植株检测多个靶基因突变情况；对仅转入1个编辑载体的T0代植株，挑选发生编辑的植株收种；收种后扩繁，挑选纯合植株；若无纯合，继续挑选T0代扩繁，直至获得纯合植株；对于转入2或n个编辑载体的T0代植株，挑选发生编辑的植株扩繁；挑选2或n个靶基因均发生纯合的植株收种；对上述T1代中未获得所有基因均纯合的植株，挑选T1代中纯合基因最多的植株扩繁，得T2代植株，挑选靶基因均发生纯合的植株收种；重复直至获得所有基因均发生纯合编辑的植株。本发明针对不同代次的基因编辑植株进行不同类别分子鉴定，高效获得多个基因发生纯合编辑的编辑素材。