本发明涉及内源性物质检测技术领域，具体涉及一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的方法，包括如下依次进行的步骤：经预处理获得含有内标的待富集处理品；使用UPLC含有内标的待富集处理品获得糖醇富集样品；使用MS/MS检测和/或量化所述糖醇富集样品中的糖醇；所述糖醇包括山梨醇、甘露醇、赤藓糖醇、核糖醇和肌醇。本方案解决了现有技术中的分析方法难以同时检测多种内源性糖醇的技术问题，且解决了同分异构体糖醇色谱难以完全分离的技术难题。该方法检测过程耗时短、相对成本低、特异性好、灵敏度高、节省劳动量，更适合应用于评价药物或者治疗方法的效果的实践操作中。