本发明公开了一种百脉根籽提取物及其制备方法和鼠李糖基尿苷的制备，所述百脉根籽提取物中包括质量含量为50％以上的鼠李糖基尿苷。本发明通过将百脉根籽除油后进行溶剂提取，再依次通过第一树脂柱和第二树脂柱进行层析，由此制备得到了含有鼠李糖基尿苷的百脉根籽提取物；再将该百脉根籽提取物进行分离步骤后获得了高纯度的鼠李糖基尿苷。本发明在百脉根籽中首次发现了5'‑O‑α‑L‑鼠李糖基尿苷，并首次实现了从植物中提取并分离得到鼠李糖基尿苷，其制备流程简便，操作可行性高，可大规模生产鼠李糖基尿苷。