本发明提供一种多色荧光显微成像系统，包括物镜、二向色镜、会聚镜、消色差中继镜组、筒镜、分束器和探测器；其中，激发光经会聚镜、二向色镜聚焦于被测物激发出荧光，荧光通过物镜收集，再经消色差中继镜组与筒镜后会聚进入分束器进行分束并分别成像在探测器上。本发明在不增加探测器、物镜等成像系统所需硬件的基础上，以较为简单的方式组成成像系统，从而提高单次采集或单位时间内的信息维度，与此同时这种成像方式还具有极高的时间分辨率。