本发明公开了一种基于多肽长度的短肽组学鉴定方法及其应用。本发明的基于多肽长度的短肽组学鉴定方法能够对指定多肽长度范围内的所有多肽片段进行例举，再逐个生成理论一级母离子和二级子离子，并不断与样品中物质所采集到的实际离子谱图数据进行比对，将符合匹配要求的多肽与相应物质进行关联，最终实现样品中物质多肽序列结构的鉴定。该方法可完全不依赖蛋白质序列数据库，直接对蛋白质酶解产物进行无死角、无遗漏式的检索和鉴定，同时，该方法对短肽采用完全匹配的评价方式，鉴定结果准确性强、可信度高，可充分弥补当下蛋白质组学分析方法和工具的不足。本发明对于提升多肽组学分析技术水平和促进行业发展具有重要意义。