本发明提供了一种脉动式气体消毒灭菌方法及灭菌系统，应用于软式内镜灭菌系统，述方法包括：利用过氧化氢雾化室生成过氧化氢气体；通过多层消毒盒搁架中任一消毒盒对应的内部腔体和/或内镜管道生成压力环境，使所述过氧化氢气体流入所述内部腔体和/或内镜管道，以利用所述过氧化氢气体对所述内部腔体和/或内镜管道进行消毒；经过所述消毒盒的过氧化氢气体流入过氧化氢分解系统后进行分解后排出所述灭菌系统。本发明通过在灭菌系统内部可以放置多个专用软式内镜消毒盒，以同时对多个软式内镜消毒盒进行单独消毒，采用过氧化氢气体消毒，无有害残留，同时相对浸没消毒，过氧化氢消耗量大大减少。