本发明涉及一种使用三相逆流色谱分离纯化天然产物的方法，其为在常规的逆流色谱的固定相中，加入固态分离介质——微球，组成一包括液态固定相、固态固定相和液态流动相的三相的分离系统，将逆流色谱方法和柱层析方法结合在一起的方法。该方法适合于分离不同种类的化合物。在应用于天然产物的分离纯化时，通过调整溶剂体系和介质颗粒的种类，实现多种选择性的组合，在一个运行过程中，将两种色谱方法结合从而改变分离系统的选择性，使两种原理的分离过程一步完成，为种类繁多、组分复杂、结构近似、有效成分含量低的天然产物的分离提供了新的技术，并解决了逆流色谱总体分辨率较低的问题。