本发明公开了一种同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片，包括经醛基化处理的玻璃片和阵列式分布于玻璃基片上的寡核苷酸探针、对照和空白的点涂层，所述点涂层是6条不同组别的人轮状病毒组特异性检测探针，1条阳性对照探针，4条阴性对照探针以及空白点样液对照，并且所述检测探针与对照探针以poly(dT)15作为连接臂，并在探针5′端加入带氨基的六碳基团。本发明还公开了所述芯片的制备方法与该芯片在制备临床诊断试剂中的应用。本发明的芯片采用多重PCR扩增方式，可同时用于对多组人轮状病毒的基因检测和组别鉴定，具有广阔的应用前景，有望满足食品卫生监测，疾病预防控制和临床医疗领域对人轮状病毒检测的需要。