本发明公开了一种玻璃基板芯片的制备方法、玻璃基板芯片及应用，涉及玻璃基板芯片技术领域。玻璃基板芯片的制备方法是通过先在基材衬底上形成含铬的硬掩膜层和光刻胶层，通过曝光在光刻胶层上形成目标流道图形，通过对硬掩膜层进行腐蚀以使目标流道图形转移至硬掩膜层上，然后采用第一浓度酸腐蚀液对基材衬底进行多次流道腐蚀并控制腐蚀速率，可以使微反应器深度与进出流道深度差更小，之后采用第二浓度酸腐蚀液进行腐蚀可以对流道粗糙度进行修饰，以获得圆滑平整的流道。通过玻璃基板芯片片制备工艺的改进，可以制备出微反应器深度与进出流道深度差更小、流道圆滑平整、粗糙度低的玻璃基板芯片，而且适合大批量生产，利于市场推广应用。