本发明涉及一种分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法，其集成了细胞破碎、层析和膜分离等技术，具体包括：将常规工艺发酵培养得到的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原培养液破碎至细胞破碎率达到50～90％；离心除去细胞碎片，调节pH值和电导率后进行阴离子交换层析，收集活性回收率大于20％以上的洗脱液；合并洗脱液，再次分别调节电导率和pH值后进行疏水层析；采用超滤膜将样品浓缩；最后使用凝胶过滤柱进行凝胶过滤，得到纯度大于99％以上的汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原。该方法纯化活性回收率高，且纯度可达到99％以上，操作步骤少，操作周期短，成本相对较低，易于放大到工业化规模生产，具有较大的实际应用价值。