本发明属于有机小分子荧光探针技术领域，具体涉及一种对粘度和硝基还原酶双响应的荧光探针及其制备方法和应用。本发明的荧光探针通过加入无水DMF和叔丁醇钾，氮气下，回流，冷却至室温，将反应液倒入冰水中，过滤，洗涤，干燥得到化合物1；加入无水乙腈、化合物1和对硝基溴化苄，在N₂保护下回流，冷却至室温，过滤，用柱层析法纯化，制得探针。所述探针对溶液中粘度变化和硝基还原酶的检测显著敏感，随着溶液粘度的增大，探针在610nm处的荧光强度显著增强；在NADPH参与下，随着硝基还原酶浓度增大，探针M440被硝基还原酶还原为化合物1，其在520nm处的荧光显著增强；经细胞实验表明所述探针能很好的定位在线粒体，检测细胞中线粒体粘度的变化以及缺氧条件下硝基还原酶的产生。