本发明属于生物医药领域，公开了一种硝基还原酶响应的诊疗一体化探针及其制备方法与应用。诊疗一体化探针的结构通式为具体制备方法为：先将双氧水和三氟乙酸酐在有机溶剂进行反应，然后加入近红外荧光染料继续反应，反应结束后，进行分离提纯，即可得到所述诊疗一体化探针。本发明的诊疗一体化探针可对肿瘤微环境中的硝基还原酶表现出荧光增强响应，用于硝基还原酶及活体肿瘤成像；同时，本发明的诊疗一体化探针在激光照射下产生活性氧，用于肿瘤的光动力治疗。本发明的诊疗一体化探针具有较高的生物安全性，且制备方法操作简便、成本低、易于推广，在恶性肿瘤的早期诊断和治疗方面具有潜在的应用价值。