本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种制备长分子测序DNA的方法。所述方法，包括以下步骤：1)改变小DNA片段的末端：将小DNA片段的突出末端变为平末端，然后在平末端增加额外的单碱基凸起；2)添加接头：向步骤1)处理后的小DNA片段中加入设计好的带有与处理后的小DNA片段单碱基凸起配对互补的接头；所述接头为一段寡核苷酸片段，该寡核苷酸片段与其互补寡核苷酸片段配对后形成的双链两端均带有单碱基，该单碱基与步骤1)处理后的小DNA片段的单碱基凸起互补配对；3)串联小DNA片段：通过添加的接头，首尾连接小DNA片段，将小DNA片段串联成长分子测序DNA。