本发明公开了一种富集糖肽的磁性聚苯胺纳米材料的制备方法和应用，磁性聚苯胺纳米材料是先由六水合三氯化铁、乙二醇及无水乙酸钠高温加热制得磁性纳米材料后，再在其表面包覆聚苯胺制得。富集糖肽方法为：将磁性聚苯胺纳米材料分散液加入到糖蛋白胰酶酶切产物中，振荡富集；将富集液磁分离后，向富集糖肽的磁性聚苯胺纳米材料中加入洗脱液进行振荡洗脱，而后进行磁分离，得到糖肽富集溶液。本发明材料和方法不仅可以获得更丰富的蛋白糖基化修饰信息和更准确的聚糖糖型，并且在不破坏蛋白质糖基化修饰结构的条件下，实现低成本、环境友好、高特异性地富集分离，操作简便，为复杂样本中蛋白质糖基化修饰研究和相关肿瘤标志物的筛查等提供了新型材料和技术方法。