本发明属于分析检测领域，公开了利用液相色谱‑串联质谱定量分析生物样本中游离氨基酸的方法。包括以下步骤：步骤1)、将生物样品进行预处理，得到处理后的生物样品；步骤2)、将步骤1)中处理后的生物样品置于冷冻离心机中离心，收集上层清液在氮吹仪下浓缩至近干；步骤3)、将步骤2)中所得的样品用溶剂混匀后用过滤，4℃储存待测；步骤4)、将步骤3)中所得的生物样品进行超高效液相色谱‑串联质谱联用分析，得到生物样品中游离氨基酸的种类和含量。本发明能够对血清、血浆、组织等不同类型的生物样本中氨基酸含量的分析，本发明待检测的生物样品分析物不需要衍生化，生物样品进行预处理方法简单。