本发明公开了一种自共焦近红外二区荧光寿命显微镜。本发明中激光光源出射后被分成两路，一路被光电二极管接收，经光电转换后传输至计数板卡，用来采集激发光脉冲信号；另一路经过准直透镜组被准直后透过二色镜，被第一透镜聚焦在小孔上，再经过第二透镜变成准直光，然后经过扫描振镜、扫描透镜和套筒透镜后，被物镜聚焦于样品上。聚焦点发出的近红外二区荧光信号按逆入射光路的方向传输，再次被聚焦于小孔上，然后被二色镜反射，经收集模块传输至光电倍增管转换成电信号，电信号再转换成电计数信号输入到计数板卡。荧光信号和激发光脉冲信号经处理后，得到样品的近红外二区荧光寿命共聚焦图像。本发明光路调节过程可控、稳定又简便。