本实用新型公开了一种微生物荧光成像装置，包括激光器，待测试微生物样本置于盖玻片与载玻片之间；激光器发出的平行激光为水平方向，在激光器的出光路线上设置一个分光片，位于分光片的折射光路的一侧设有萤石物镜，其折射光路的反向一侧依次设有滤光片、套筒透镜和CMOS相机，CMOS相机与一台电脑相连；激光器发出的平行激光通过分光片反射后垂直向下穿过萤石物镜打在载玻片上，放置于载玻片上的待测试微生物样本中的生物粒子被激发出荧光，荧光向上依次穿过萤石物镜、分光片和滤光片，并由套筒透镜聚焦后进入相机，并在电脑上显示成像。本实用新型将原始光激光和激发光荧光分开，仅有荧光进入相机，使得成像效果更接近样品实物、更真实。