本发明公开了一种巯基化透明质酸多糖水凝胶及其制备方法和应用。所述巯基化透明质酸多糖水凝胶是由巯基化透明质酸衍生物中的一种或两种与水性溶剂形成的多糖水凝胶，其中，所述巯基化透明质酸衍生物的质量百分比浓度为3~6%，所述巯基化透明质酸衍生物的巯基取代度为3~20%。本发明制备的巯基化透明质酸多糖水凝胶，通过透明质酸的羟基、羧基接枝侧链基团，并控制适中的巯基取代度，增加巯基化透明质酸多糖水凝胶的分子间和分子内的支撑性，既可以增加水凝胶的柔软性又可以保持较好的回弹性，保持凝胶形态，达到用于玻璃体替代物的性能要求。本发明的水凝胶作为玻璃体替代物可以提高减震功能，良好的自愈合功能和回弹性可以保持眼球形状和顶压视网膜在原位。