本发明提供了一种反硝化脱氮生物填料及其制备方法和应用，涉及污水处理技术领域。本发明采用具有一定空间网状结构的β‑环糊精作为主体，首先在氢氧化钠乙醇溶液中浸泡可以活化填料外围的羟基官能团，方便用卤素原子取代；硫氢化钠乙醇溶液能将卤元素进一步替换成巯基官能团，将硫元素负载于填料中；而后脱水缩合能将巯基官能团进一步转换成更为稳定、具有改性空间网状结构的二硫键；经过热熔造粒成型后得到反硝化脱氮生物填料。本发明制备的反硝化脱氮生物填料能够实现硫自养与异养耦合反硝化脱氮效果，在保证处理效率的同时，解决了现有的自养和异养反硝化处理中挂膜时间长、处理效率存在瓶颈、出水二次污染等问题。