本发明提供了一种负载二茂铁的耦合反硝化脱氮生物填料及其制备方法和应用，属于水处理填料技术领域。本发明提供的反硝化脱氮生物填料包括填料基体和负载于所述填料基体表面的二茂铁，其填料基体中含有硫磺，其析出硫作为硫源被脱氮硫杆菌利用形成硫自养反硝化；同时，填料基体中还含有淀粉和聚乙烯醇，能够作为异养反硝化的内碳源，与水处理时外加的外碳源共同将硝态氮和亚硝态氮转换为氮气脱除。本发明填料基体表面负载有二茂铁，具有吸附作用，能够极大地提高微生物的附着和生长，进一步提升硝态氮和亚硝态氮的去除率；且二茂铁通过酯基负载于填料基体表面，使得填料的外表面具备一定的空间网状结构，进一步增强了填料的强度和缓释性能。