本发明公开了一种检测基因变异的核苷酸组合物及其构建的高通量测序文库，属于基因检测技术领域。本发明提供的核苷酸组合物基于探针差异连接，用于检测目标模板中的变异，目标模板与非目标模板至少存在一个碱基的变异，包括阻滞探针、连接探针一和连接探针二：阻滞探针与非目标模板特异性结合；目标模板上设有不相连的连接探针一和连接探针二，连接探针一和连接探针二与目标模板特异性结合，且分别位于目标模板变异位点的两侧，与目标模板变异位点互补的碱基位于连接探针一或连接探针二上。本发明的核苷酸组合物能够检测核酸样本中低至0.1％的变异信息，基于此构建的高通量测序文库不需要高深度的测序，测序数据量小，可检测位点数大大增加。