本发明公开了一种基于自适应网格的荧光暗场自动对焦方法，方法的步骤中含有：相机按照设定的步进长度由上往下依次向下步进并聚焦生物样本组成，得多张聚焦图像；在得多张聚焦图像的过程中包括如下步骤：S1:对聚焦图像执行动作M：划分网格，通过无参考图像的清晰度评价方法评价各网格的清晰度，得各网格的清晰度评价数值，寻找清晰度评价数值最高的网格，即为标定网格，并将该标定网格以及其邻域网格组成处理区域；S2：对下次聚焦图像中处理区域对应的区域执行动作M：S3：重复步骤S2，直至处理区域的面积小于设定值，此时小于设定值的处理区域为固定处理区域。它能够在相机聚焦图像的过程中找出需要位置的聚焦图像，操作方便。