本发明属于生物细胞培养领域，具体公开了一种人T淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用，所述无血清培养基包括基础培养基、无血清添加剂、复合脂类和中药单体活性成分；所述无血清添加剂包括：人血白蛋白、人转铁蛋白、重组人胰岛素；所述中药单体活性成分包括：黄芪黄酮、黄芪多糖、甘草多糖、丹参多糖、灵芝多糖；该培养基适用于在不额外添加血清或自体血浆的条件下，分离、激活和培养人来源的T淋巴细胞，支持T细胞快速增殖和高密度生长，提高细胞活性，维持相对稳定的细胞表型，优化不同细胞亚型的比例，提高T细胞回输的效果。