本发明公开了抗氧化短肽M5、其制备方法及应用，属于生物医药技术领域，抗氧化短肽M5，抗氧化短肽M5为直链小肽，含有9个氨基酸残基，全序列一级结构为：苯丙氨酸‑亮氨酸‑脯氨酸‑甘氨酸‑酪氨酸‑谷氨酸‑半胱氨酸‑缬氨酸‑色氨酸。抗氧化短肽M5的制备方法，包括以下步骤：S1：根据短肽的氨基酸序列合成得到粗多肽，S2：将合成得到的粗多肽进行层析脱盐纯化，得到纯化后的多肽，S3：通过质谱确定纯化后的多肽的分子量，S4：测定纯化后的多肽的氨基酸序列结构。本发明的抗氧化短肽M5、其制备方法及应用，抗氧化短肽M5具有分子量小、结构简单、溶血活性低、细胞毒性极低的优点，具有极强的抗氧化活性，且制备方法简单。