本发明涉及用于检测mRNA可变剪切变异的试剂盒、建库方法和测序方法，试剂盒包括用于扩增靶基因目的片段的特异性上游引物和特异性下游引物，目的片段包含mRNA可变剪切变异片段，特异性上游引物的3’端互补配对于mRNA可变剪切变异片段相邻的第一外显子区域，特异性下游引物的3’端互补配对于mRNA可变剪切变异片段相邻的第二外显子区域，以使得目的片段的起始位置位于第一外显子区域内，目的片段的终止位置位于第二外显子区域内。本发明的试剂盒通过设计靶基因目的片段的引物对待测样本cDNA一步扩增、建库，并对扩增产物进行上机测序，能够获取靶基因发生mRNA可变剪切变异形成的异常转录本序列信息以及异常转录本比例，提高了mRNA可变剪切变异的检测效率。