本发明涉及一种利用荧光定量PCR检测多基因位点突变的方法，所述方法包括正向特异引物、反向特异引物和特异性荧光探针，其中，所述正向特异引物的长度为15‑25个碱基，其序列和待测序列一条链互补；所述反向特异引物的长度为15‑25个碱基，其序列和待测序列的另一条链互补，所述的正向特异引物和反向特异引物的Tm值均为50‑65℃，且二者的Tm值的差≤5℃；所述特异性荧光探针的长度为35‑50个碱基，其序列和野生型待测序列互补，包括Blocker部分和Reporter部分，所述特异性荧光探针的Tm值比正向特异性引物的Tm值高15‑25℃。克服了现有技术的不足，采用本发明的特殊引物、探针结构，能够显著减少非特异性扩增，提高了区别野生型和突变型序列的能力，其检测灵敏度可低至0.01％。