本发明公开了一种基于宏基因组学的毒素基因丰度检测方法及注释数据库构建方法，属于生物信息技术领域，包括以下步骤：S1、样本采集并且建库测序，获得待测样本的宏基因组测序数据；S2、对所述宏基因组测序数据进行筛选，得到测序序列；S3、对所述测序序列与毒素基因参考数据库进行比对，获取每个基因的比对reads数量；S4、根据基因长度将reads数量标准化为相对丰度，然后基于内参基因序列的拷贝数计算每个毒素基因的绝对丰度；其中所述新的毒素因子参考序列数据库是通过添加已知量的内参基因序列到毒素因子参考序列数据库中形成的。采用该检测方法，可以检测出疾病相关的毒素因子基因，能够更准确的反映样本中基因的真实拷贝数和样本组间的真实差异。