本发明属于显微镜技术领域，公开了一种显微成像锁焦系统、方法及显微镜，包括光源、第一透镜、第二透镜、第三透镜、探测器和物镜位移控制器；光源照射载玻片后形成反射光线依次经过第一透镜、第二透镜和第三透镜，第一透镜和第二透镜组用于放大偏移量，第三透镜用于将反射光束汇聚到呈第一角度设置的探测器，探测器用于比较反射光束所形成的第一光斑的第一位置和预存的初始光斑的初始位置，根据第一位置和第二位置向物镜位移控制器发送第一控制信号。有益效果：入射光不经物镜入射的锁焦系统，进行锁焦时对显微成像系统的依赖以及影响可以忽略不计；锁焦系统的器件数量少，机构精简，降低了加工装调难度，更易实现的模块化系统。