本发明提供一种基于在线孪生支持向量回归机的发酵过程软测量方法，属于工业发酵生产过程软测量建模和应用领域。该方法首先对青霉素生产过程中的辅助变量进行归一化处理，然后对辅助变量和产物青霉素浓度的非线性关系进行基于在线孪生支持向量回归机的软测量建模。通过发酵过程中易于测量的辅助变量对难测量的产物青霉素浓度进行在线软测量，并且该方法对于模型的更新十分高效，为青霉素发酵生产过程的产物青霉素浓度的在线实时测量提供一种方法。本软测量方法能够提高在线预测的实时性，减少模型更新的时间，且具有较高的预测精度，可有效用于指导青霉素生产。