本发明提供了一种鱼皮脱细胞真皮基质及其制备方法和应用，该制备方法包括将新鲜鱼皮预处理后，经过清洗、消毒、脱细胞处理、病毒灭活、去重金属清洗、保护液处理和终端灭菌等过程，本发明的鱼皮脱细胞真皮基质材料的制备方法中没有使用化学交联剂，无需引入有机溶剂，可有效控制热原、细菌等污染风险，制备工艺可控性强，依据本发明方法所制备的鱼皮脱细胞真皮基质材料比鱼源原材料热稳定性更好，更适合用于人体软组织修复再生；另外，本发明的脱细胞鱼皮基质材料较好地保留组织的天然三维结构，可为细胞或组织的再生提供良好的仿生微环境；同时又能保留脱细胞基质材料良好的力学性能和柔韧性，更好地满足临床要求。