本发明提供了一种多层包覆的量子点荧光编码微球及其制备方法，属于量子点制备技术领域。方法包括以下步骤：S1、制备聚合物微球内包覆量子点的量子点种子微球，所述量子点种子微球的表面含有碳碳双键；S2、将油溶性单体和引发剂分散在乳化剂溶液中，经超声分散或者高速均质形成单体液滴；S3、将所述量子点种子微球和所述单体液滴混合，在惰性气体保护下进行聚合反应，然后向反应体系内加入功能单体进行接枝反应，反应结束后进行纯化处理，得到多层包覆的量子点荧光编码微球。本发明制备得到的微米级的量子点荧光编码微球尺寸均一、单分散性好，具有高荧光强度、高荧光强度稳定性，可同时实现荧光光谱编码和荧光强度编码。